小黑楊抗逆基因工程育種研究

目錄
前言
1小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 1
1.1 抗生素對小黑楊葉片離體培養(yǎng)的影響 1
1.1.1 不同濃度卡那霉素對小黑楊生長的影響 1
1.1.2 不同濃度G418 對小黑楊生長的影響 3
1.2 抑菌劑的抑菌效果及對小黑楊生長的影響 4
1.2.1 頭孢類抗生素對農(nóng)桿菌的抑制作用 4
1.2.2 AgNO3 對農(nóng)桿菌的抑制作用 6
1.2.3 抑菌劑對小黑楊葉片分化的影響 6
1.2.4 AgNO3 對小黑楊葉片分化的影響 8
1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小黑楊轉(zhuǎn)基因體系的建立 9
1.3.1 不同處理對小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化的影響 9
1.3.2小黑楊卡那霉素抗性芽的篩選 13
1.3.3 轉(zhuǎn)化株系的擴繁與生根 13
1.4 確定小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系 14
2 轉(zhuǎn)betA 基因小黑楊研究 17
2.1 轉(zhuǎn)betA小黑楊的獲得 17
2.1.1 轉(zhuǎn)betA小黑楊抗性不定芽的獲得 17
2.1.2 轉(zhuǎn)betA小黑楊PCR 檢測 18
2.1.3 轉(zhuǎn)betA小黑楊Southern 雜交 18
2.2 轉(zhuǎn)betA小黑楊耐鹽性分析 19
2.2.1 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)betA小黑楊甜菜堿含量的比較 20
2.2.2 非脅迫下轉(zhuǎn)betA小黑楊甜菜堿含量的時序變化 20
2.2.3 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)betA小黑楊甜菜堿含量的時序變化 21
2.2.4 轉(zhuǎn)betA小黑楊在輕度鹽堿地的生長表現(xiàn) 22
3 轉(zhuǎn)codA 基因小黑楊研究 25
3.1 轉(zhuǎn)codA小黑楊的獲得 25
3.1.1 將codA 整合到小黑楊基因組 25
3.1.2 codA 基因在mRNA 水平的表達 27
3.2 轉(zhuǎn)codA小黑楊耐鹽堿性分析 28
3.2.1 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)codA小黑楊的生長表現(xiàn) 28
3.2.2 NaHCO3 脅迫下轉(zhuǎn)codA小黑楊的生長表現(xiàn) 31
4 轉(zhuǎn)抗蟲基因小黑楊研究 34
4.1 轉(zhuǎn)抗蟲基因小黑楊的獲得 34
4.1.1小黑楊抗蟲基因的遺傳轉(zhuǎn)化 34
4.1.2 轉(zhuǎn)抗蟲基因小黑楊PCR 檢測 35
4.1.3 轉(zhuǎn)抗蟲基因小黑楊Southern 雜交 35
4.2 轉(zhuǎn)基因小黑楊對舞毒蛾幼蟲的毒殺能力 36
5 轉(zhuǎn)TaLEA 基因小黑楊研究 38
5.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的獲得 38
5.1.1 將TaLEA 整合到小黑楊基因組中 38
5.1.2 TaLEA 基因在mRNA 水平的表達 39
5.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的耐鹽性提高 40
5.2.1 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊相對電導(dǎo)率比較 40
5.2.2 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 41
5.2.3 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊凈光合速率比較 41
5.2.4 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊葉綠素含量比較 42
5.2.5 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊耐鹽株系的選擇 42
5.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的抗旱性提高 43
5.3.1 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊相對電導(dǎo)率比較 43
5.3.2 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 43
5.3.3 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊凈光合速率比較 43
5.3.4 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊葉綠素含量比較 44
5.3.5 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊抗旱株系的選擇 45
5.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的耐寒性提高 45
5.4.1 低溫脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 45
5.4.2 低溫脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊相對高生長比較 45
5.4.3 低溫脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊冷害指數(shù)比較 46
5.4.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊耐寒株系的選擇 46
6 轉(zhuǎn)TaLEA 基因小黑楊表達特性研究 49
6.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊基因表達譜分析 49
6.1.1 差異基因的功能分類 49
6.1.2 差異基因的基因本體和代謝途徑分析 49
6.1.3 差異基因的qRT-PCR 驗證 52
6.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊蛋白表達譜分析 55
6.2.1 差異蛋白的功能分類 55
6.2.2 差異蛋白與差異基因的比較 56
7 轉(zhuǎn)TaLEA 基因小黑楊生長穩(wěn)定性研究 62
7.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗期生長性狀Logistic 模型構(gòu)建 62
7.1.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高和地徑方差分析 62
7.1.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高年生長模型構(gòu)建 63
7.1.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊地徑年生長模型構(gòu)建 65
7.1.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高年生長階段劃分 67
7.1.5 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊地徑年生長階段劃分 68
7.1.6 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高、地徑與速生期各參數(shù)關(guān)系 68
7.1.7 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系苗高生長過程比較 69
7.2 不同地點轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊遺傳穩(wěn)定性分析 71
7.2.1 不同地點轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊樹高和胸徑的變異 71
7.2.2 不同地點不同轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系A(chǔ)MMI 方差分析 73
7.2.3 不同地點不同轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系的基因型-環(huán)境交互作用 73
7.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊多性狀比較 74
7.3.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系間各性狀比較 74
7.3.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系間各性狀平均值及變異參數(shù)分析 77
7.3.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系各性狀相關(guān)分析 77
7.3.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系綜合評價 79
8 轉(zhuǎn)PsnWRKY70 基因小黑楊研究 81
8.1 生物及非生物脅迫條件下PsnWRKY 時序表達特性 81
8.1.1 PsnWRKY 基因及蛋白質(zhì)特征 82
8.1.2 PsnWRKY 蛋白多序列比對及進化分析 83
8.1.3 不同脅迫條件下PsnWRKY 表達的時序變化 86
8.2 PsnWRKY70 啟動子功能研究 89
8.2.1 PsnWRKY70 啟動子的克隆及轉(zhuǎn)錄起始位點的確定 89
8.2.2小黑楊cDNA 文庫的構(gòu)建及質(zhì)量檢測 92
8.2.3 酵母單雜交篩選PsnWRKY70 的上游調(diào)控因子 93
8.2.4 酵母單雜交篩選結(jié)果的驗證 98
8.3 酵母雙雜交篩選PsnWRKY70 的互作蛋白 100
8.3.1 誘餌載體的構(gòu)建 100
8.3.2 誘餌載體的自激活檢測 101
8.3.3 WRKY 蛋白在酵母細胞中的表達 103
8.3.4 pGBKT7-WRKY 與pGADT7-cDNA 共轉(zhuǎn)化后的篩選 103
8.3.5 陽性克隆的驗證 104
8.3.6 陽性克隆所攜cDNA 片段的生物信息學(xué)分析 105
8.3.7 互作蛋白的GST-pull down 體外驗證 106
8.4 PsnWRKY70 基因功能研究 111
8.4.1 PsnWRKY70 在小黑楊不同組織部位的表達特性 112
8.4.2 PsnWRKY70 植物表達載體的構(gòu)建 112
8.4.3 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊的獲得 115
8.4.4 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊耐鹽性分析 119
8.4.5 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊耐旱性分析 123
8.4.6 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊抗病性分析 125
8.4.7 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊轉(zhuǎn)錄組分析 128
參考文獻 138