典型微囊藻毒素微生物降解技術(shù)及原理

1 緒論
1．1 MCs的物化特性及其毒性
1．1．1 MCs的物化特性
1．1．2 MCs的毒性
1．2 MCs的提取提純及分析測定
1．2．1 MCs的提取提純研究進(jìn)展
1．2．2 MCs的分析測定研究進(jìn)展
1．3 MCs污染的控制
1．3．1 物理法
1．3．2 氧化降解法
1．3．3 生物降解法
2 研究內(nèi)容及技術(shù)路線
2．1 研究目標(biāo)
2．2 研究內(nèi)容
2．2．1 菌種篩選及其生理生化特征研究
2．2．2 菌株的分子生物學(xué)鑒定
2．2．3 茵株降解MC-RR特性
2．2．4 基因USTB-05-A的克隆
2．2．5 基因USTB-05-A的表達(dá)
2．2．6 菌株降解MC-RR的第一步分子途徑及機理
2．3 技術(shù)路線
3降解MC-RR菌株的篩選與生理生化特征
3．1 實驗材料與儀器設(shè)備
3．1．1 藍(lán)藻藻樣
3．1．2 菌種來源
3．1．3 微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
3．1．4 藥品與試劑
3．1．5 主要儀器
3．2 實驗方法
3．2．1 MC-RR的分析測定
3．2．2 MC-RR提取提純
3．2．3 菌種篩選
3．2．4 菌株細(xì)胞形態(tài)觀察
3．2．5 菌株生長曲線的繪制
3．2．6 菌株耐鹽性研究
3．2．7 菌株耐酸堿性研究
3．2．8 茵株抗生素抗性研究
3．3 MC-RR的提取提純結(jié)果
3．4 菌種篩選結(jié)果
3．4．1 混合茵種篩選
3．4．2 純菌種篩選
3．5 菌落形態(tài)觀察及革蘭氏染色
3．6 USTB-05的生長曲線
3．7 菌株USTB-05的耐鹽性
3．8 菌株USTB-05的耐酸堿性
3．9 USTB-05對抗生素的抗性
3．10 本章小結(jié)
4 菌株USTB-05的分子生物學(xué)鑒定
4．1 實驗材料
4．1．1 菌株和質(zhì)粒
4．1．2 培養(yǎng)基
4．1．3 PCR引物
4．1．4 藥品與試劑
4．1．5 常用的生物信息分析的相關(guān)軟件及網(wǎng)站．
4．1．6 主要儀器
4．2 實驗方法
4．2．1 USTB-05基因組DNA的提取
4．2．2 PCR反應(yīng)體系及步驟
4．2．3 瓊脂糖凝膠電泳
4．2．4 目的基因的回收
4．2．5 目的基因與pGEM-T Easy載體連接
4．2．6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞
4．2．7 質(zhì)粒的提取
4．2．8 陽性克隆鑒定與測序
4．2．9 16S rDNA序列分析與茵屬鑒定
4．3 USTB-05基因組DNA的提取結(jié)果
4．4 16S rDNA的PCR擴增結(jié)果
4．5 16S rDNA片段序列分析結(jié)果
4．5．1 去栽體
4．5．2 BLAST搜索
4．6 系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制
4．7 本章小結(jié)
5 USTB-05對MC-RR的降解特性研究
5．1 實驗材料
5．1．1 菌種與試劑
5．1．2 主要儀器
5．2 實驗方法
5．2．1 溶解氧對USTB-05降解MC-RR的效應(yīng)．
5．2．2 溫度對USTB-05降解MC-RR的影響
5．2．3 pH值對USTB-05降解MC-RR的影響
5．2．4 USTB-05菌株對MC-RR的降解-
5．2．5 USTB-05菌株無細(xì)胞提取液（CE）制備
5．2．6 CE對MC-RR的降解
5．3 溶解氧的效應(yīng)
5．4 溫度的影響結(jié)果
5．5 初始pH值的影響結(jié)果
5．6 不同培養(yǎng)條件下USTB-05的生長情況
5．7 USTB-05菌株對MC-RR的降解
5．8 無細(xì)胞提取液對MC-RR的降解
5．9 本章小結(jié)
6 基因USTB-OS-A的克隆
6．1 實驗材料
6．1．1 菌種
6．1．2 藥品及試劑
6．1．3 主要溶液
6．1．4 主要儀器
6．2 實驗方法
6．2．1 PCR獲取USTB-05降解基因簇片段
6．2．2 DNA凝膠電泳
6．2．3 目的片段回收
6．2．4 目的片段與T載體連接
6．2．5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞
6．2．6 質(zhì)粒提取
6．2．7 陽性克隆鑒定及測序
6．2．8 反向PCR獲取USTB-05未知序列
6．2．9 高保真PCR獲取USTB-05菌完整降解基因．
6．2．10 設(shè)計基因USTB-05-A克隆引物
6．2．11 PCR擴增、連接T載體、轉(zhuǎn)化及鑒定
6．2．12 pGEX-4T-1載體獲得
6．2．13 目的基因與pGEX-4T-1載體制備
6．2．14 重組質(zhì)粒pGEX-USTB-05-A／BL21（DE3）構(gòu)建
6．2．15 陽性克隆鑒定及測序
6．3 降解MC-RR基因初步探索
6．4 反向PCR擴增未知序列
6．4．1 反向PCR擴增結(jié)果
6．4．2 序列分析拼接
6．5 高保真PCR獲取USTB-05菌降解MC-RR完整基因
6．5．1 高保真PCR
6．5．2 序列拼接
6．5．3 獲取開放閱讀框（ORF）
6．6 PCR擴增USTB-05-A基因
6．7 克隆重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的陽性鑒定
6．8 T Easy／USTB-05-A測序結(jié)果
6．9 USTB-05-A基因與pGEX-4T-1載體雙酶切
6．10 表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的陽性鑒定
6．11 本章小結(jié)
7 基因USTB-05-A的表達(dá)
7．1 實驗材料
7．1．1 菌種及主要藥劑
7．1．2 主要溶液
7．1．3 主要儀器
7．2 實驗方法
7．2．1 SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)表達(dá)
7．2．2 USTB-05-A基因工程茵總蛋白提取及濃度測定
7．2．3 影響誘導(dǎo)表達(dá)單因素條件試驗
7．2．4 最佳條件下的重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
7．2．5 重組蛋白酶包涵體鑒定
7．2．6 重組蛋白酶的分離純化
7．2．7 表達(dá)蛋白酶的活性驗證
7．2．8 基因工程茵與USTB-05茵體降解MC-RR活性對比
7．3 影響表達(dá)量的單因素影響結(jié)果
7．4 最佳條件下重組蛋白酶誘導(dǎo)表達(dá)
7．5 包涵體驗證結(jié)果
7．6 表達(dá)蛋白降解MC-RR活性驗證
7．7 重組蛋白酶初步分離
7．8 USTB-05菌體與基因工程菌降解MC-RR活性對比
7．9 本章小結(jié)
8 USTB-05催化降解MC-RR第一步機理
8．1 實驗材料
8．1．1 主要溶液
8．1．2 主要儀器
8．2 實驗方法
8．2．1 重組蛋白酶對MC-RR的降解
8．2．2 MC-RR第一個降解產(chǎn)物質(zhì)譜分析
8．3 重組蛋白酶對MC-RR的降解結(jié)果
8．4 MC-RR第一個降解產(chǎn)物質(zhì)譜分析
8．5 USTB-05降解MC-RR第一步途徑推測
8．6 本章小結(jié)
9 結(jié)論與展望
9．1 主要結(jié)論
9．2 主要創(chuàng)新點
9．3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄 USTB-05-A基因與mlrA基因序列