生物制藥實(shí)用技術(shù)

第一章緒論1 一、生物制藥技術(shù)突飛猛進(jìn)，生物制藥產(chǎn)業(yè)不斷涌現(xiàn)1 二、癌癥研究取得新突破4 三、阿爾茨海默病、帕金森病、腦卒中及脊椎外傷研究取得新進(jìn)展7 四、自身免疫性疾病有了新的治療途徑7 五、人體器官移植進(jìn)展迅速8 六、預(yù)防和治療心腦血管疾病有了新手段8 七、預(yù)防和治療病毒感染有了新希望9 第二章原核細(xì)胞基因工程制藥技術(shù)11 第一節(jié)原核細(xì)胞基因工程藥物研制技術(shù)簡(jiǎn)述11 一、基因工程藥物11 二、原核細(xì)胞基因質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建15 三、基因工程菌株的構(gòu)建21 四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌（構(gòu)建基因工程菌）21 第二節(jié)工程菌高密度發(fā)酵27 一、發(fā)酵罐的消毒滅菌27 二、接種培養(yǎng)發(fā)酵29 三、菌體收集29 四、菌體破碎29 第三節(jié)包含體復(fù)性33 一、包含體蛋白復(fù)性方法33 二、提高包含體蛋白的復(fù)性產(chǎn)率34 第三章真核細(xì)胞表達(dá)蛋白藥物研制40 第一節(jié)目的基困的獲得40 一、目的基因獲得的途徑40 二、基因擴(kuò)增一—PCR技術(shù)41 第二節(jié)真核細(xì)胞常用表達(dá)載體42 一、pEGFP—N1載體的特點(diǎn)42 二、GFp42 三、克隆化的真核基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)43 第二節(jié)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一般程序44 一、試劑準(zhǔn)備44 二、操作步驟44 三、SHG—44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染45 四、G418篩選45 第四節(jié)載體構(gòu)建步驟48 一、克隆構(gòu)建48 二、載體的選擇49 三、體外重組49 四、重組子的篩選49 五、克隆載體導(dǎo)入受體細(xì)胞52 第五節(jié)克隆載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞53 一、化學(xué)轉(zhuǎn)染53 二、物理轉(zhuǎn)染54 三、重組表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染55 第六節(jié)重組基因工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)59 一、重組基因工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)操作程序59 二、激流式生物反應(yīng)器63 三、中空纖維生物反應(yīng)器65 第四章基因重組蛋白的純化67 第一節(jié)目標(biāo)蛋白的粗純化H67 一、離子交換色譜法67 二、疏水相互作用色譜69 三、親和色譜70 四、融合蛋白的純化72 五、反膠團(tuán)萃取74 六、濁點(diǎn)萃取法75 七、硫酸接分級(jí)沉淀法（鹽析法）79 八、且又水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)81 第二節(jié)目標(biāo)蛋白精純化87 一、凝肢色譜87 二、雙水相高速逆流色譜法90 第二節(jié)目標(biāo)蛋白大規(guī)模純化94 一、重組人血清白蛋白（rHSA）的分離提純94 二、Streamline擴(kuò)張床純化重組蛋白96 第四節(jié)目標(biāo)蛋白去病毒工藝101 一、離子交換色譜去除病毒工藝101 二、凝肢色譜去除病毒工藝102 三、親和色譜去除病毒工藝103 四、疏水相互作用色譜去病毒工藝103 五、去除滅活病毒的其他方法104 第五節(jié)重組蛋白冷凍干燥工藝109 一、冷凍干燥的意義109 二、蛋白質(zhì)干的保護(hù)劑110 三、退火111 四、干燥 五、真空度112 六、冷凍干燥操作步驟112 第六節(jié)重組蛋白產(chǎn)品的穩(wěn)定性觀察113 一、觀測(cè)樣品114 二、觀測(cè)條件114 三、測(cè)定項(xiàng)目115 四、觀察時(shí)間116 五、運(yùn)輸穩(wěn)定性研究116 六、結(jié)果的分析116 七、標(biāo)示117 八、名詞解釋117 九、重組人尿激酶原穩(wěn)定性觀察117 第五章目標(biāo)蛋白產(chǎn)晶質(zhì)量檢測(cè)121 第一節(jié)目標(biāo)蛋白純度和生物活性檢測(cè)121 一、目標(biāo)蛋白定量測(cè)定121 二、目標(biāo)蛋白產(chǎn)品的純度檢測(cè)126 三、目標(biāo)蛋白分子質(zhì)量測(cè)定129 四、目標(biāo)蛋白生物活性測(cè)定131 五、目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)測(cè)定132 第二節(jié)重組蛋白中宿主細(xì)胞殘留物檢測(cè)135 一、目標(biāo)蛋白產(chǎn)品中宿主細(xì)胞蛋白殘留量檢測(cè)135 二、目標(biāo)蛋白產(chǎn)品中宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)140 一、目標(biāo)蛋白產(chǎn)品中牛血清蛋白殘留量檢測(cè)141 四、重組目標(biāo)蛋白產(chǎn)品中熱原值檢測(cè)143 五、重組蛋白純化工藝中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)檢測(cè)147 六、基因重組蛋白藥品報(bào)送國(guó)家食品藥品檢定研究院檢驗(yàn)148 七、工程細(xì)胞株和細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)量控制152 第六章重組蛋白的結(jié)構(gòu)分析與鑒定158 第一節(jié)重組蛋白肽圖分析158 一、重組人干擾素α1b的膚圖分析158 二、液質(zhì)聯(lián)用分析重組人白細(xì)胞介素—11的肽圖159 第二節(jié)重組蛋自糖基定位和糖鏈組成分析161 一、糖鏈的釋放161 二、氣相色譜法測(cè)定重組蛋白的糖鏈組成164 第三節(jié)重組蛋白氨基酸分析165 一、目標(biāo)蛋白的水解165 二、目標(biāo)蛋白的氨基酸分析168 第四節(jié)重組蛋白圓二色性光譜分析和紫外光譜分析183 一、圓二色譜分析原理183 二、圓二色性尤譜實(shí)驗(yàn)步驟185 三、試驗(yàn)結(jié)果185 四、蛋白質(zhì)紫外吸收光譜測(cè)定186 第五節(jié)重組蛋白的免疫原檢測(cè)187 一、材料與方法187 二、實(shí)驗(yàn)步驟187 三、聚丙烯眈滕凝肢的配制188 四、轉(zhuǎn)膜189 五、凝肢圖像分析190 第七章重組基因工程藥物的藥效學(xué)研究191 一、動(dòng)物種屬／模型的選擇191 二、給藥劑量的設(shè)置192 三、人源重組蛋白在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的免疫原性193 四、毒代動(dòng)力學(xué)研究194 五、重組人尿激酶尿的藥效學(xué)試驗(yàn)196 六、rhPro—UK對(duì)豬冠狀動(dòng)腺血栓的溶栓作用198 第八章基因重組藥物的臨床前安全評(píng)價(jià)201 第一節(jié)基因重組藥物急性毒性試驗(yàn)201 一、喝齒類(lèi)動(dòng)物單次給藥的急性毒性試驗(yàn)201 二、非嗤齒類(lèi)動(dòng)物的急性毒性試驗(yàn)（近似致死，劑量試驗(yàn)）203 三、說(shuō)明204 四、LD50的測(cè)定204 第二節(jié)重組蛋白藥品的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)206 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物207 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理207 三、試驗(yàn)方法207 四、說(shuō)明209 第二節(jié)基因重組藥物的特殊毒性試驗(yàn)211 一、微核試驗(yàn)211 二、致突變?cè)囼?yàn)214 三、致癌試驗(yàn)217 四、致畸試驗(yàn)218 第四節(jié)基因重組蛋自的一般藥理學(xué)研究225 一、藥理學(xué)所用的生物材料226 二、受試藥物226 三、受試動(dòng)物教226 四、給藥劑量226 五、重組人尿激酶原的一般藥理學(xué)研究226 第九章基因重組蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)研究231 第一節(jié)藥物動(dòng)力學(xué)指導(dǎo)作用231 一、藥物動(dòng)力學(xué)隔室模型232 二、藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)232 三、藥物動(dòng)力學(xué)方程234 四、藥物動(dòng)力學(xué)尿藥數(shù)據(jù)法進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)分析234 五、藥物動(dòng)力學(xué)以血藥濃度法建立的藥物動(dòng)力學(xué)方程235 六、靜脈滴垃和靜脈注射聯(lián)合用藥236 七、藥物動(dòng)力學(xué)統(tǒng)計(jì)矩法237 第二節(jié)藥物的吸收、分布、排泄240 一、藥物的吸收240 二、藥物動(dòng)力學(xué)生物利用度和藥物動(dòng)力學(xué)模型判刑方法241 三、藥物的組織分布243 四、藥物的排泄243 五、藥物與血漿蛋白的結(jié)合244 六、重組人尿激酶原（rhPro—UK）的藥物動(dòng)力學(xué)研究245 七、重組人尿激酶原的組織分布249 第十章基因重組生物藥物的注冊(cè)申報(bào)252 第一部分治療用生物制品252 一、注冊(cè)分類(lèi)252 二、申報(bào)資料項(xiàng)目253 三、申報(bào)資料要求254 四、申報(bào)資料說(shuō)明254 五、關(guān)于臨床試驗(yàn)的說(shuō)明258 六、進(jìn)行Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)的程序258 七、進(jìn)口治療用生物制品申報(bào)資料和要求259 第二部分預(yù)防用生物制品260 一、注冊(cè)分類(lèi)260 二、申報(bào)資料項(xiàng)目261 三、申報(bào)資料的說(shuō)明262 四、關(guān)于臨床試驗(yàn)的說(shuō)明264 五、進(jìn)口預(yù)防用生物制品申報(bào)資料和要求265 參考文獻(xiàn)267 附錄1研究者手冊(cè){以重組人尿激酶原為范本）273 一、新生物制品臨床研究申請(qǐng)表273 二、中國(guó)食品藥品檢定研究院274 三、重組人尿型纖溶酶原激活劑（rhPro—UK）的藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和藥放學(xué)的臨床前研究工作總結(jié)277 四、有關(guān)尿激酶原（Pro—UK）的國(guó)內(nèi)外研究綜述286 附錄2知情同意書(shū)新生物藥晶臨床試驗(yàn)知情同意書(shū)的設(shè)計(jì)規(guī)范及范例289