基因工程

nbsp; 1.1  基因工程概貌
    1.1.1  基因工程的誕生和興起
    1.1.2  基因工程的特點與基本步驟
    1.1.3  基因工程早期的開創(chuàng)性研究成就
  1.2  基因工程技術(shù)的應用與發(fā)展趨勢
    1.2.1  全球性的基因工程爭奪戰(zhàn)
    1.2.2  蛋白質(zhì)工程的研究開發(fā)飛速發(fā)展
    1.2.3  轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)藥物的研究迅速崛起
    1.2.4  醫(yī)學科學研究取得巨大成就
    1.2.5  基因治療技術(shù)取得重大進展
    1.2.6  規(guī)模空前的國際《人類基因組計劃》提前完成
  1.3  基因工程與生物制藥
    1.3.1  基因工程制藥發(fā)展態(tài)勢
    1.3.2  主要基因工程藥物簡介
2  基因工程常用的工具酶
  2.1  限制性核酸內(nèi)切酶
    2.1.1  限制酶的發(fā)現(xiàn)
    2.1.2  限制酶的種類
    2.1.3  限制酶的命名
    2.1.4  Ⅱ型限制酶的特性
    2.1.5  限制片段末端連接
  2.2  DNA連接酶
    2.2.1  DNA連接酶連接作用的特點
    2.2.2  基因工程中常用的連接酶
    2.2.3  DNA連接酶連接作用的分子機理
  2.3  DNA聚合酶
    2.3.1  大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ
    2.3.2  K1enow大片段酶
    2.3.3  T4噬茵體DNAR聚合酶
    2.3.4  經(jīng)修飾的T7噬茵體DNA聚合酶
    2.3.5  TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶
    2.3.6  反轉(zhuǎn)錄酶
  2.4  DNA修飾酶
    2.4.1  末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶
    2.4.2  堿性磷酸酶
    2.4.3  T4噬菌體多核苷酸激酶
  2.5  單鏈核酸內(nèi)切酶
    2.5.1  Sl核酸酶
    2.5.2  Bal31核酸酶
  2.6核酸外切酶
    2.6.1  核酸外切酶Ⅶ
    2.6.2  核酸外切酶Ⅲ
    2.6.3  λ核酸外切酶
3  基因工程常用的克隆載體
  3.1  質(zhì)粒載體
    3.1.1  質(zhì)粒概述
    3.1.2  質(zhì)粒DNA分子的特性
    3.1.3  質(zhì)粒載體的改造和構(gòu)建
    3.1.4  DBR322質(zhì)粒載體
    3.1.5  DUC質(zhì)粒載體
    3.1.6  其他重要的質(zhì)粒載體
  3.2  λ噬菌體載體
    3.2.1  λ噬菌體的基本特性
    3.2.2  λ噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)與功能
    3.2.3  λ噬菌體載體的構(gòu)建
    3.2.4  常用的λ噬菌體載體
    3.2.5  改良型λ噬菌體載體
  3.3  粘粒載體
    3.3.1  粘粒載體的構(gòu)建
    3.3.2  粘粒載體的特點
    3.3.3  常用的粘粒載體
  3.4  M13噬菌體載體
    3.4.1  M13噬菌體的基本特性
    3.4.2  M13噬菌體載體的構(gòu)建
    3.4.3  M13噬茵體載體系列的優(yōu)點
  3.5  噬菌粒載體
    3.5.1  pUC118和pUCll9噬菌粒載體
    3.5.2  pBluescript噬菌粒載體
  3.6  哺乳動物細胞載體系統(tǒng)
    3.6.1  SV40載體
    3.6.2  牛乳頭瘤病毒（BPV）載體
    3.6.3  EBV病毒載體
4目的基因的制取
  4.1  目的基因的化學合成
    4.1.1  目的基因的設(shè)計
    4.1.2  寡聚核苷酸片段的合成
    4.1.3  寡核苷酸片段的分離和純化
    4.1.4  用寡核苷酸片段組裝目的基因
    4.1.5  化學合成寡核苷酸的其他用途
  4.2  構(gòu)建基因文庫法分離目的基因
    4.2.1  構(gòu)建基因文庫法分離目的基因的基本步驟
    4.2.2  真核基因組DNA文庫的構(gòu)建過程
  4.3  酶促合成法制取目的基因
    4.3.1  真核生物細胞中的mRNA
    4.3.2  從構(gòu)建的cDNA文庫中篩選目的cDNA
    4.3.3  RT-PCR法合成目的cDNA
5  目的基因與克隆載體的體外重組
  5.1  目的基因與質(zhì)粒載體的連接
    5.1.1  粘性末端連接法
    5.1.2  定向克隆法
    5.1.3  平末端連接法
    5.1.4  同聚物加尾法
    5.1.5  加人工接頭連接法
    5.1.6  加DNA銜接物連接法
    5.1.7  其他轉(zhuǎn)換末端形式連接法
  5.2  目的基因與入噬菌體載體的連接
    5.2.1  λ噬茵體載體臂DNA的制備
    5.2.2  λ噬菌體載體臂與外源目的DNA片段的連接
6  重組克隆載體引入受體細胞
  6.1  基因工程受體細胞
    6.1.1  受體細胞的特性
    6.1.2  重組體分子導入受體細胞的途徑
  6.2  重組體DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染
    6.2.1  用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法
    6.2.2  用復合劑制備感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法
    6.2.3  高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法（電轉(zhuǎn)化法）
  6.3  重組λ噬菌體DNA的體外包裝與轉(zhuǎn)導
    6.3.1  λ噬茵體體外包裝的基本原理
    6.3.2  λ噬菌體DNA的體外包裝
    6.3.3  包裝提取物的制備
    6.3.4  重組λDNA的體外包裝與感染方法
  6.4  重組克隆載體導人哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染
    6.4.1  磷酸鈣和DNA共沉淀物轉(zhuǎn)染法
    6.4.2  DEAE-葡聚糖介導轉(zhuǎn)染法
    6.4.3  利用Polybrene（聚季銨鹽）的DNA轉(zhuǎn)染法
    6.4.4  利用原生質(zhì)體融合的DNA轉(zhuǎn)染法
    6.4.5  電穿孔法DNA轉(zhuǎn)染
7  含目的基因重組體的篩選、鑒定與分析
  7.1  重組體（菌）的篩選
    7.1.1  抗生素抗性基因插入失活法
    7.1.2  β-半乳糖苷酶基因插入失活法
    7.1.3  快速細胞破碎與凝膠電泳篩選法
    7.1.4  放射性標記核酸探針雜交篩選法
    7.1.5  免疫化學篩選法
  7.2  重組體的鑒定
    7.2.1  酶切及凝膠電泳鑒定法
    7.2.2  Southern印跡雜交法
    7.2.3  電鏡R-環(huán)檢測法
    7.2.4  基因產(chǎn)物鑒定法
  7.3  重組DNA的序列分析
    7.3.1  sanger-雙脫氧鏈終止法DNA測序
    7.3.2  Maxam-Gilbert化學修飾法DNA測序
    7.3.3  快速自動化DNA測序
8  目的基因在宿主細胞中的表達
  8.1  外源目的基因在原核細胞中的表達
    8.1.1  原核基因表達載體的構(gòu)成
    8.1.2  常見的原核細胞表達載體系統(tǒng)
    8.1.3  外源目的基因在原核細胞的表達形式
    8.1.4  在原核細胞中高效表達目的基因
    8.1.5  基因定點誘變技術(shù)
  8.2  外源目的基因在真核細胞中的表達
    8.2.1  真核細胞表達載體的功能元件
    8.2.2  酵母茵表達系統(tǒng)
    8.2.3  哺乳動物細胞表達系統(tǒng)
9  基因工程藥物無性繁殖系的組建
  9.1  人胰島素原融合蛋白重組菌的組建
    9.1.1  重組表達質(zhì)粒pJG202的構(gòu)建與鑒定
    9.1.2  重組質(zhì)粒pJG202在大腸桿菌中的表達
    9.1.3  融合蛋白后處理成為人胰島素原
  9.2  人a2b型干擾素工程菌的組建
    9.2.1  hIFN-a2b基因的獲得
    9.2.2  重組表達質(zhì)粒pMZI2B的構(gòu)建
    9.2.3  人a2b型干擾素工程菌的形成與基因的表達
  9.3  集落刺激因子工程菌的組建
    9.3.1  細胞總RNA的提取
    9.3.2  PCR引物的設(shè)計與合成
    9.3.3  RT-PCR法制備GM-CSF cDNA
    9.3.4  GM-CSF重組表達載體與工程菌的組建
  9.4  白細胞介素融合蛋白工程菌的組建
    9.4.1  質(zhì)粒與PCR引物
    9.4.2  人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造
    9.4.3  IL2-PE-pLY5重組質(zhì)粒的構(gòu)建
  9.5  乙型肝炎表面抗原重組酵母的組建
    9.5.1  BsAg基因重組表達質(zhì)粒pLS1和pLS2的構(gòu)建
    9.5.2  重組表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及HBsAg的表達
    9.5.3  重組表達質(zhì)粒在酵母細胞中的穩(wěn)定性
  9.6  人組織型纖溶酶原激活劑細胞株的組建
    9.6.1  真核表達質(zhì)粒pLFrGGI的構(gòu)建
    9.6.2  高效表達FrGGI（tPA突變體）的CHO細胞株的獲得
    9.6.3  去除dhfr基因轉(zhuǎn)錄增強子的作用
  9.7  紅細胞生成素CHO細胞株的組建
    9.7.1  質(zhì)粒與細胞株
    9.7.2  EPO真核重組表達質(zhì)粒pMGL4的構(gòu)建
    9.7.3  重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞及產(chǎn)物表達
    9.7.4  重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞及EPO表達
  9.8  人腫瘤壞死因子昆蟲細胞株的組建
    9.8.1  含hTNF-a基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    9.8.2  共轉(zhuǎn)染與重組病毒的獲得
    9.8.3  重組病毒感染Sf2l細胞及hTNF-a的表達
10  基因工程藥物的生產(chǎn)
  10.1  基因工程菌（細胞）的培養(yǎng)與發(fā)酵
    10.1.1  工程細菌的培養(yǎng)與發(fā)酵
    10.1.2  工程酵母的培養(yǎng)與發(fā)酵
    10.1.3  工程細胞的培養(yǎng)與發(fā)酵
  10.2  基因工程藥物的分離純化
    10.2.1  影響分離純化工藝設(shè)計的主要因素
    10.2.2  各種產(chǎn)物表達形式采用的分離純化方法
  10.3  基因工程藥物的分離純化實例
    10.3.1  以包涵體形式表達的rGM-CSF中試分離純化
    10.3.2  以分泌型表達的人a1-干擾素的分離純化
    10.3.3  以可溶性形式表達的rhG-CSF的分離純化
    10.3.4  在酵母中表達的HBsAg的分離純化
11  基因工程藥物的檢驗
  11.1  基因工程藥物的質(zhì)量控制
    11.1.1  主要的基因工程藥物
    11.1.2  基因工程藥物的特點
    11.1.3  基因工程藥物的質(zhì)量要求
    11.1.4  基因工程藥物的質(zhì)控要點
    11.1.5  基因工程藥物的制造及檢定規(guī)程
  11.2  基因工程藥物常用的檢驗方法
    11.2.1  化學檢定法
    11.2.2  肽圖分析法
    11.2.3  外源性DNA殘留量的測定
    11.2.4  宿主細胞蛋白雜質(zhì)的檢測
    11.2.5  無菌試驗
    11.2.6  內(nèi)毒素試驗
    11.2.7  異常毒性試驗
    11.2.8  熱原質(zhì)試驗
    11.2.9  生物學活性（效價）檢定
  11.3  主要基因工程藥物的檢驗
    11.3.1  重組人胰島素的檢驗
    11.3.2  重組人生長激素的檢驗
    11.3.3  重組人干擾素的檢驗
    11.3.4  重組人白細胞介素的檢驗
    11.3.5  重組人紅細胞生成素的檢驗
    11.3.6  重組人集落刺激因子的檢驗
    11.3.7  重組人組織型纖溶酶原激活劑的檢驗
    11.3.8  重組人腫瘤壞死因子的檢驗
    11.3.9  重組乙型肝炎疫苗的檢驗
附錄
參考文獻